Elementy enzymologii i biochemii białek Uniwersytet śląski (Uniwersytet Śląski)

Tytuł komponenty enzymologii i biochemii białek Podtytuł Skrypt dla studentów biologii i biotechnologii Autorzy Urszula Guzik, Danuta Wojcieszyńska Język polski Wydawnictwo Uniwersytet Śląski ISBN 978-83-8012-446-2 seria Podręczniki i Skrypty UŚ; Biologia Rok wydania 2015 Katowice Wydanie 1 liczba stron 78 Format pdf Spis treści Spis treści Przedmowa / 9 Wykaz użytkowanych oznaczeń / 11 Zasady bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązujące w Pracowni biochemii białek / 13 1. Izolacja i oczyszczanie enzymu / 15 1.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej / 15 1.1.1. WPROWADZENIE / 15 1.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 18 1.1.3. WYKONANIE / 19 1.1.3.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2 / 19 1.1.3.2. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej / 21 1.1.3.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda / 22 1.1.3.3.1. Przygotowanie krzywej wzorcowej / 22 1.1.3.3.2. Oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym / 23 1.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 23 1.2. Wyznaczanie mas cząsteczkowych białek metodą sączenia żelowego i oczyszczanie białek metodą chromatografii jonowymiennej / 24 1.2.1. WPROWADZENIE / 24 1.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 25 1.2.3. WYKONANIE / 26 1.2.3.1. Wyznaczenie masy cząsteczkowej 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą sączenia żelowego / 26 1.2.3.2. Oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą chromatografii jonowymiennej / 28 1.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 29 1.3. Elektroforeza dwuwymiarowa 2-DE białek / 30 1.3.1. WPROWADZENIE / 30 1.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 32 1.3.3. WYKONANIE / 32 1.3.3.1. Przygotowanie ascetycznej frakcji enzymatycznej do elektroforezy 2-DE / 32 1.3.3.2. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczania stężenia białka metodą Bradforda w obecności buforu do przygotowywania próbek 2-DE / 33 1.3.3.3. Rehydratacja pasków IPG / 34 1.3.3.4. Izoogniskowanie białek z wykorzystaniem pasków IPG / 34 1.3.3.5. Przygotowanie pasków do drugiego kierunku SDS-PAGE i rozdział elektroforetyczny / 35 1.3.3.6. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue / 36 1.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 36 1.4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących / 36 1.4.1. WPROWADZENIE / 36 1.4.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 38 1.4.3. WYKONANIE / 38 1.4.3.1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek / 38 1.4.3.2. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue oraz metodą srebrową / 39 1.4.4. OPRACOWANIE I DOKUMNETACJA WYNIKÓW / 40 1.5. Literatura / 40 2. Kinetyka reakcji enzymatycznej katalizowanej przez 1,2-dioksygenazę katecholową / 43 2.1. Wyznaczanie słusznych warunków reakcji enzymatycznej / 43 2.1.1. WPROWADZENIE / 43 2.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 44 2.1.3. WYKONANIE / 45 2.1.3.1. Badanie wpływu temperatury na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 45 2.1.3.2. Badanie wpływu pH na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 46 2.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 47 2.2. Wyznaczanie stałych kinetycznych reakcji enzymatycznej / 48 2.2.1. WPROWADZENIE / 48 2.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 51 2.2.3. WYKONANIE / 52 2.2.3.1. Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 52 2.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 53 2.3. Inhibicja reakcji enzymatycznych / 54 2.3.1. WPROWADZENIE / 54 2.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 55 2.3.3. WYKONANIE / 56 2.3.3.1. Badanie wpływu 2,4-dichlorofenolu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 56 2.3.3.2. Badanie wpływu jonów niklu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 57 2.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 58 2.4. Literatura / 59 3. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61 3.1. Wpływ immobilizacji na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61 3.1.1. WPROWADZENIE / 61 3.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 62 3.1.3. WYKONANIE / 63 3.1.3.1. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 63 3.1.3.2. Oznaczanie stężenia białka w kulkach alginianowych / 63 3.1.3.2.1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej dla oznaczania stężenia białka metodą Bradforda w występowaniu KOH / 63 3.1.3.2.2. Oznaczanie stężenia białkach w kulkach alginianowych metodą Bradforda w występowaniu KOH / 64 3.1.3.3. Oznaczanie aktywności immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 64 3.1.3.4. Wpływ czasu przechowywania na aktywność wolnego i immobilizowanego enzymu / 65 3.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 66 3.2. Badanie cechy immobilizowanego enzymu / 67 3.2.1. WPROWADZENIE / 67 3.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 68 3.2.3. WYKONANIE / 69 3.2.3.1. Badanie wpływu pH na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 69 3.2.3.2. Badanie wpływu temperatury na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 70 3.2.3.3. Badanie wpływu jonów metali oraz związków fenolowych na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 71 3.2.3.4. Oznaczanie stężenia białka w bezkompromisowej frakcji enzymatycznej i w kulkach alginianowych / 72 3.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 73 3.3. Literatura / 74